Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

規(guī)格:20T/50T/100T，價(jià)格：400/700/1200元，產(chǎn)品簡(jiǎn)介

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Annexin V可選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。與FITC的綠色熒光信號(hào)相比，EGFP的綠色熒光信號(hào)具有信號(hào)強(qiáng)，不易淬滅，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。

試劑盒組份

試劑盒組份 20 assays  50 assays 100 assays儲(chǔ)存條件

Annexin V-EGFP 100μL 250μL 500μL 4℃避光

結(jié)合液 15 mL 40 mL 75mL 4℃

碘化丙啶 （PI） 100μL 250μL 500μL 4℃避光

試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、移液器,1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

操作步驟

1、對(duì)于懸浮細(xì)胞：A、在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-EGFP的結(jié)合。）B、取1~5×105重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。C、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。D、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。E、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測(cè)，滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞即可檢測(cè)。2、對(duì)于貼壁細(xì)胞：A、把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用胰酶細(xì)胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細(xì)胞。（注：胰酶消化時(shí)間不易過長(zhǎng)，否則容易引起假陽性）B、細(xì)胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。C、取1~5×105重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。D、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。F、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測(cè)，滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞即可檢測(cè)。3、對(duì)于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測(cè)：注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測(cè)不到。A、(選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)；或?qū)⒓?xì)胞于蓋玻片上生長(zhǎng)，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對(duì)照組。B、吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌兩次；或?qū)⑸w玻片用PBS洗滌兩次。（選做步驟：用250ul的結(jié)合液洗滌蓋玻片一遍）C、在500μL 的結(jié)合液中加入5μL Annexin V-EGFP， 5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。D、將上述溶液滴加于培養(yǎng)板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘; 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。

保存條件

4℃保存，Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長(zhǎng)期保存，可以把Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存，Annexin V-EGFP結(jié)合液可以直接-20℃保存。

注意事項(xiàng)

1、如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。2、染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。同時(shí)熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。3、如果檢測(cè)時(shí)Annexin V-EGFP的熒光比較弱，建議用250ul的結(jié)合液輕輕重懸洗滌細(xì)胞，去除殘余的磷酸鹽溶液，同時(shí)也可縮小結(jié)合液的體積（比如200ul的體積）來提高Annexin V-EGFP的工作濃度。4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。5、本試劑盒適用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×105，，不適用于檢測(cè)組織樣本。6、因檢測(cè)細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測(cè)儀器不同，因而流式檢測(cè)的熒光補(bǔ)償也不同，因此建議每次檢測(cè)均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。7、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm; 發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測(cè)；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測(cè)，建議使用FL3。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。