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細(xì)胞凍存操作方法與注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2024-04-28      瀏覽次數(shù):159

很多同學(xué)都遇到過這個(gè)問題:自己養(yǎng)的細(xì)胞開始長的還挺好的,可是凍存之后復(fù)蘇會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不好甚至

復(fù)蘇不起來。出現(xiàn)這種問題很有可能就是你的凍存環(huán)節(jié)出了問題。


當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下時(shí),細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,冰晶的大小對(duì)細(xì)胞有

影響是不同的,大冰晶容易造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂,因此就會(huì)造成我們復(fù)蘇出來的細(xì)胞存活率、

狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。那么我們要怎么解決這些問題呢?首先我們?cè)趦龃娴倪^程中要減少冰晶的形成

,尤其是大冰晶的形成:緩慢凍存細(xì)胞,可使細(xì)胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。


那么我們?cè)撛鯓觾龃婕?xì)胞呢?

一、慢凍細(xì)胞

1、常規(guī)程序:

使用程序降溫盒

當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí),1-2℃/min。

當(dāng)溫度在-25℃以下時(shí),5-10℃/min。

當(dāng)溫度達(dá)到-100℃時(shí),可迅速轉(zhuǎn)入液氮中。

2、簡易程序:

冷凍管管口朝上,放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘下降1-2℃的

速度,在40min內(nèi)降至液氮表面過夜,次晨投入液氮中。

3、傳統(tǒng)程序:

冷凍管置于4℃ 10min,-20℃ 30min,-80℃ 16-18h(或隔夜),液氮長期儲(chǔ)存。


二、低溫保護(hù)劑

常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,它是一種滲透保護(hù)劑,可迅速透入細(xì)胞,提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,降低冰點(diǎn),

延緩凍結(jié)過程,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的

損傷。


三、細(xì)胞凍存方法

1、預(yù)先配制凍存液:

凍存液比例多種,根據(jù)細(xì)胞的特性進(jìn)行調(diào)整凍存液的比例:

5%—10%DMSO + 20%—90%血清 + 0%—70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液;

2、取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,去除舊培養(yǎng)液,用PBS清洗1-2次;去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清;

3、加入適量胰酶(濃度一般為0.25%),使胰酶覆蓋整個(gè)瓶,放入培養(yǎng)箱消化;

4、細(xì)胞消化0.5-2min(具體時(shí)間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷),顯微鏡下觀察細(xì)胞,細(xì)胞胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間不再連接成片

,此時(shí)加入培養(yǎng)基終止消化;

5、用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞,形成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min;

6、棄上清,加入適量預(yù)先配制好的凍存液,巴氏吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中的細(xì)胞最終密度

為5×106/ml~1×107/ml;

7、將細(xì)胞分裝入凍存管中,每管1-1.5ml;

8、凍存管標(biāo)記細(xì)胞名稱,凍存時(shí)間,操作者及細(xì)胞代數(shù)信息。


對(duì)于懸浮細(xì)胞凍存,則直接收集離心細(xì)胞,除去胰酶消化的步驟,其他步驟相同。


注意事項(xiàng)

1、需凍存保種的細(xì)胞應(yīng)在生長良好且存活率高,其密度約為80-90%的狀態(tài)。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好,

無污染。

2、在細(xì)胞凍存過程中,所結(jié)的冰晶對(duì)細(xì)胞傷害較大,所以過程一定要慢。凍存或者復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。




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