活體細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書

YIJI 活體細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 活體細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑是一種旨在通過特異性染色劑分析線粒體膜心磷脂的變

化來定性或定量測定線粒體內(nèi)含質(zhì)量以及自由基、氧化物等對細(xì)胞線粒體的毒性與損傷作用的而經(jīng)典

的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老、

代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

心磷脂（Cardiolipin）是線粒體膜上的主要成分之一。它對細(xì)胞氧化特別敏感。線粒體脂類分解，致使心磷

脂顯著減少，zui終造成線粒體的嚴(yán)重?fù)p害。Nonyl-Acrydine Orange（NAO）是一種可自由通過細(xì)胞膜的染

色劑，特異性地染色線粒體上的心磷脂，并發(fā)出熒光。一旦線粒體膜質(zhì)量減少或受到損害以及被氧化，其

熒光顯著減弱。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI 清理液（Reagent A）        毫升

YIJI 染色液（Reagent B）       微升

YIJI 稀釋液（Reagent C）        毫升

YIJI 保存液（Reagent D）        毫升

產(chǎn)品說明書                     1份

保存方式

保存 YIJI 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照，其余的保存在 4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于細(xì)胞脫離*細(xì)胞培養(yǎng)液（YJ12052）：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15 毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器

1.5 毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

比色皿：用于細(xì)胞熒光分析的容器

熒光顯微鏡：用于觀察熒光細(xì)胞

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

1

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 脫離或懸浮細(xì)胞分析

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C），混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。同時(shí)開啟熒光顯微鏡或熒光光度儀。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備 1 瓶 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測細(xì)胞（約 1 X 106細(xì)胞）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面

4． 小心抽去 YIJI 清理液（Reagent A）

5． 加入 xx 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶表面

6． 置入 37℃培養(yǎng)箱 1 分種

7． 震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

8． 加入 4 毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

9． 移入到 15 毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞可以從這一步驟開始）

10．移取 10 微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

11．移出 1 X 106細(xì)胞到新的 15 毫升錐形離心管

12．放進(jìn)臺式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

13．小心抽去上清液

14．加入 xx 毫升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 稀釋液（Reagent C）的 YIJI 染

色工作液，輕柔混勻

15．放進(jìn) 37℃恒溫水槽孵育 20 分鐘，避免光照

16．放進(jìn)臺式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

17．小心抽去上清液

18．加入預(yù)冷的 xx 微升 YIJI 保存液（Reagent D），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群

19．放進(jìn)冰槽里

20．即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析（選擇下列其中一種）：

（A）波長 580nm（紅光），觀察 50000 個(gè)細(xì)胞以上

波峰左移，表明線粒體受到損害或被氧化，活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒

體損傷或氧化）

（B）波長 488nm（綠光），觀察 50000 個(gè)細(xì)胞以上

波峰左移或降低，表明線粒體受到損害或被氧化，活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低

（線粒體損傷或氧化）

21．或使用熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1） 移出 50 微升在載玻片上

2） 即刻進(jìn)行載玻片壓片（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長 580nm，散發(fā)波長 630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長 495nm，散發(fā)波長 519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

22．或使用熒光分光光度儀

2

1） 移取 xx 微升染色后的細(xì)胞樣品到用戶自備的 1 毫升比色皿

2） 加入 xx 微升 YIJI 保存液（Reagent D）

3） 上下傾倒混勻

4） 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測讀：濾波器激發(fā)波長 580nm，散發(fā)波長 630nm或?yàn)V波器激發(fā)波長 495nm，

散發(fā)波長 519nm：活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對

熒光單位（RFU）降低

二、貼壁細(xì)胞分析（熒光酶標(biāo)儀法定量分析）

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）在室溫下融化，YIJI 稀

釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 毫升 YIJI 稀釋液（Reagent C）到新的

15 毫升錐形離心管，加入 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B），混勻后，在室溫下靜置，并標(biāo)記為

YIJI 染色工作液，放在暗室里。同時(shí)開啟熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀。然后進(jìn)行下列操作。

1． 從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板

2． 小心抽去每孔中的培養(yǎng)液

3． 小心加入 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A）到 96 孔板中每一個(gè)孔里

4． 小心抽去每孔中的 YIJI 清理液（Reagent A）（注意：確保培養(yǎng)孔中無任何液體殘留）

5． 小心加入 xx 微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI稀釋液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液到 96 孔板中每一個(gè)孔里

6． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里，孵育 20 分鐘

7． 小心抽去每孔中的 YIJI 染色工作液（注意：確保培養(yǎng)孔中無任何液體殘留）

8． 小心加入 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A）到 96 孔板中每一個(gè)孔里

9． 放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：濾波器激發(fā)波長 580nm，散發(fā)波長 630nm，閃爍次數(shù) 10，間隔時(shí)間 0.5 秒

或?yàn)V波器激發(fā)波長 495nm，散發(fā)波長 519nm，閃爍次數(shù) 10，間隔時(shí)間 0.5 秒：活性氧族含量高，脂類

物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低

三、切片染色分析

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C），混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。同時(shí)開啟熒光顯微鏡。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備 1 個(gè)待測的切片樣品

2． 小心加上 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋切片表面

3． 小心移去切片上的 YIJI 清理液（Reagent A）

4． 小心加上 xx 微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI 稀釋液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液，覆蓋切片表面

5． 放進(jìn) 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育 20 分鐘

6． 小心移去切片上的染色液

7． 小心加上 xx 微升新鮮的 YIJI 清理液（Reagent A）

8． 小心移去 YIJI 清理液（Reagent A）

9． 蓋上蓋玻片

3

10．即刻在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長 580nm，散發(fā)波長 630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長 495nm，散發(fā)波長 519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 400 次（4 個(gè) 96 孔板）、200 次（200 個(gè)切片）或 20 次操作（1 毫升處理液）

2． 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 染色劑可以自由進(jìn)入細(xì)胞

5． 孵育時(shí)，必須避免光照

6． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析

7． 紅光檢測具有特異性，而綠光檢測線粒體質(zhì)量變化

8． 細(xì)胞流式儀分析細(xì)胞檢測量不得少于 10000 個(gè)

9． 如果出現(xiàn)紅光或綠光增強(qiáng)或右移，可能出現(xiàn)染料與胞漿內(nèi)脂類物質(zhì)非特異性結(jié)合，因此根據(jù)不同細(xì)胞

類型，調(diào)整 YIJI 染色工作液的使用劑量（1：100 至 1：1000 容量比），避免過度染色，干擾檢

測

10．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰