細(xì)胞計(jì)數(shù)通用步驟有什么？有何注意事項(xiàng)？

細(xì)胞計(jì)數(shù)是指對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量測(cè)定的方法。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定細(xì)胞培養(yǎng)的密度和數(shù)量，可以掌握細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。同時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)也是衡量不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)之一。那么你知道細(xì)胞計(jì)數(shù)通用步驟有什么嗎？有何注意事項(xiàng)呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、細(xì)胞計(jì)數(shù)的通用方法

1. 以貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞為例，消化后的細(xì)胞充分重懸吹散，取一部分轉(zhuǎn)移至干凈的EP管內(nèi)，例如1mL;

2. 使用酒精棉球輕輕擦拭計(jì)數(shù)板表面和蓋玻片，把后者的邊緣微微濕潤(rùn)，然后小心蓋在計(jì)數(shù)板的正中間，邊緣要能覆蓋住計(jì)數(shù)板上的凹槽；

3. 將剛才轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)的細(xì)胞懸液再次進(jìn)行重復(fù)吹打，直到成為單細(xì)胞懸液，然后吸20uL懸液出來(lái)；

4. 將移液器吸頭抵在蓋玻片的上邊緣或下邊緣，然后緩緩打出液體，此時(shí)液體會(huì)因?yàn)楹缥饔帽晃肷w玻片和計(jì)數(shù)板之間的空隙內(nèi)；

5. 調(diào)整顯微鏡，使用10倍物鏡觀察，此時(shí)，視野內(nèi)看到的畫(huà)面應(yīng)該如下圖所示的中間圓形的紅色區(qū)域；

6. 接下來(lái)，要計(jì)算圖中藍(lán)色區(qū)域的25個(gè)格子內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，這一塊區(qū)域的總面積是1mm2；

7. 計(jì)算出總數(shù)后，按照下方公式進(jìn)行計(jì)算，得到的結(jié)果就是細(xì)胞濃度，單位是個(gè)/mL

「25個(gè)格子內(nèi)的細(xì)胞總數(shù) x 10,000 = 細(xì)胞濃度」

8. 進(jìn)一步計(jì)算，可以得到細(xì)胞總數(shù)。

「重懸細(xì)胞的培養(yǎng)基體積 x 細(xì)胞密度 = 細(xì)胞總數(shù)」

二、血球計(jì)數(shù)板的注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞懸液的制備：需要將細(xì)胞懸液che底吹散為單細(xì)胞懸液，否則大量細(xì)胞團(tuán)塊的存在會(huì)讓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果有偏差；單細(xì)胞懸液準(zhǔn)備好后，應(yīng)立即往下操作，而不能等，否則細(xì)胞又會(huì)慢慢聚集沉降成團(tuán)；

2. 計(jì)數(shù)階段：有的細(xì)胞會(huì)剛好落在計(jì)數(shù)板小方格的線上，此時(shí)，要遵循數(shù)左不數(shù)右，數(shù)上不數(shù)下的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)；

3.細(xì)胞太多或太少：如果數(shù)完25個(gè)格子，總數(shù)在200-500之間（圖a），可以繼續(xù)往下?lián)Q算；

如低于200，則應(yīng)該把整個(gè)懸液區(qū)域一起計(jì)數(shù)（圖b），然后得數(shù)乘以1111得到細(xì)胞濃度；

如果大于500，則應(yīng)該重新計(jì)數(shù)，但只計(jì)算25個(gè)放個(gè)內(nèi)的單條對(duì)角線上的5個(gè)格子的總數(shù)（圖c），然后乘以50,000得到細(xì)胞濃度；